Високошвидкісна 3D-візуалізація

Високошвидкісна 3D-візуалізація за допомогою багатофокусного 25-камерного мікроскопу

    У роботі запропоновано новий підхід до тривимірної візуалізації живих біологічних об’єктів у реальному часі. Автори створили систему M25, що поєднує масив із 25 високошвидкісних камер та багатофокусну дифракційну оптику. Це дозволяє отримувати одночасні зображення на 25 фокальних площинах, уникаючи необхідності послідовного сканування, яке обмежує традиційні методи (наприклад, конфокальна або світлолистова мікроскопія).  
    Принцип роботи системи пояснюється на рисунку 1: промінь від зразка через багатофокусну ґратку (MFG) ділиться на 25 дифракційних порядків, що відповідають різним площинам фокусування. Кожне зображення проектується на окрему камеру, утворюючи своєрідну “мозаїку” з фокальних зрізів. Завдяки спеціальній геометричній деформації ґратки досягається корекція аберацій за умовою Аббе. Це дозволяє уникнути втрати чіткості та контрасту навіть на значних відстанях від нульового фокуса.

Рисунок 1
(а) Схема проходження променя через багатофокусну ґратку (MFG), що формує 25 фокальних площин, які фіксуються синхронізованим масивом із 5×5 камер.
(b) Приклад зображення показує дві флуоресцентно мічені нематоди C. elegans, зняті зі швидкістю 50 об’ємів/с.
(с) Наведено ілюстрацію спотворення ґратки для корекції аберацій

    Особлива увага приділяється усуненню хроматичної дисперсії, властивої дифракційним елементам. На рисунку 2 показано модульну систему корекційних дифракційних ґраток (CCG), інтегрованих у кожен об’єктив камер. Вони компенсують зміщення зображення різних довжин хвиль, яке могло б знизити роздільну здатність. Такий підхід значно спрощує конструкцію порівняно з класичними багатокомпонентними призмово-ґратковими модулями.

Рисунок 2 
(a) Корекція хроматичної дисперсії.
(b) Корекційні ґратки (CCG), вмонтовані в об’єктиви камер, компенсують довгохвильові зсуви, викликані MFG.
(c) Фото 25-камерного масиву з інтегрованими CCG демонструє модульну конструкцію.

    Якість зображення перевірялася на флуоресцентних мікробідах (200 нм). Як видно з рисунку 3(a – c), система демонструє ізотропну просторову роздільну здатність у межах 337 нм у площині XY та близько 821 нм по осі Z. Стабільність підтверджується тим, що роздільна здатність зберігається на всіх 25 площинах. Додатково на рисунку 3(b,d,e) показано експерименти з дифузією мікробід у воді, які були відзняті зі швидкістю 125 об’ємів за секунду. Це доводить здатність системи працювати без втрати кадрів та з високою точністю відстеження частинок.

Рисунок 3 – Перевірка роздільної здатності та продуктивності.          
(a) Точкова функція розсіювання (PSF) від 200-нм бід у діапазоні 50 мкм підтверджує ефективну корекцію аберацій.
(b) Диффузія 1-мікронних бід, зафіксована зі швидкістю 125 об’ємів/с. (c) Криві FWHM у напрямках x, y, z.
(d – e) Відеотрекінг частинок у 3D та розраховані коефіцієнти дифузії, що збігаються з теоретичними значеннями

    Справжні можливості M25 продемонстровані на прикладі живих організмів. На рисунку 4 показано серце личинки Drosophila melanogaster. Флуоресцентна візуалізація дозволила відстежити ядра клітин, тоді як світлопольний режим надав структурний контекст без необхідності маркування. Автори змогли зафіксувати скорочення серцевого м’яза із частотою близько 2 Гц та побудувати кінограму руху тканини.

Рисунок 4 – Імагінг серця личинки Drosophila melanogaster.
(a) Флуоресцентне зображення ядер клітин, мічених H2B-EGFP.
(b) Відповідне світлопольне зображення.
(c) Послідовні кадри скорочення серцевої тканини.
(d) Інтенсивність уздовж лінії скорочення.
(e) Кімограф, що відображає динаміку серцевих скорочень протягом 5 секунд.

    На рисунку 5 наведено результати експериментів із C. elegans, які демонструють чергування скорочень антагоністичних м’язів під час руху нематоди. Візуалізація кальцієвої активності (за допомогою GCaMP) показує чітку синхронізацію між дорсальними та вентральними м’язовими групами. Побудований кінограф (криві вигинів тіла) дає змогу кількісно описати локомоцію.

Рисунок 5 – М’язова активність у вільно рухомих C. elegans.
(a) Кадр кальцієвої візуалізації з використанням GCaMP.
(b) Розташування ROI уздовж тіла: дорсальні (зелені) та вентральні (помаранчеві) м’язи.
(c) Типові пози під час руху.
(d) Кімограф дорсовентральних вигинів у часі.
(e) Флуоресцентні сигнали, що показують почергову активність м’язів під час прямолінійного руху.

    Подальший розвиток методики видно на рисунку 6, де відстежено окремі нейрони у вільно плаваючій нематоді. Використовуючи алгоритми сегментації (StarDist3D) і трекінгу (Ultrack), автори продемонстрували можливість аналізу активності нервових клітин без іммобілізації організму.

Рисунок 6 – Відстеження нейронів у C. elegans.
(a) Сире зображення з пан-нейрональною експресією GCaMP у вільно плаваючій нематоді.
(b) Сегментація й трекінг нейронів у середній частині тіла, відображені у часі.

    Нарешті, рисунок 7 ілюструє локалізацію та часову динаміку кальцієвих сигналів у нейронах голови C. elegans. Два нейрони з різних площин показують різні патерни активності, що підкреслює здатність M25 відстежувати події на субклітинному рівні в 3D.

Рисунок 7 – Кальцієва активність нейронів у голові C. elegans.
(a) Приклад площини з сегментованими нейронами.
(b) Візуалізація траєкторій нейронів у кількох площинах.
(c – d) Нормалізовані кальцієві сигнали від двох нейронів, розташованих у різних z-площинах, що демонструють відмінності у часовій активності.
    Розробка відкриває шлях до систематичного вивчення швидких біологічних процесів – від скорочень серця й м’язової активності до нейронних сигналів у рухомих організмах. Автори наголошують, що конструкцію можна масштабувати (15, 25 чи 49 площин) і адаптувати під різні моделі, а також поєднувати з гіперспектральними чи суперрезолюційними методами.