Дифракційні мінімуми розрізняють точкові розсіювачі на кількох сотих довжини хвилі
У фізиці є важливе питання: наскільки малою може бути відстань d між двома одночасно розсіюючими точковими джерелами, щоб їх можна було розрізнити за допомогою (оптичних) хвиль з довжиною хвилі λ? Підручник з оптики дає відповідь на це питання – критерій Релея, який стверджує, що відстань між дифракційними максимумами розсіювачів на зображенні має бути більшою за d = 0.61λ/(nsinα), де n і α позначають показник заломлення середовища та кут напівапертури лінзи відповідно. Незважаючи на те, що критерій Релея був уведений для дальньопольової мікроскопії, він також працює і для сканувальної оптичної мікроскопії, де об’єкт сканують сфокусованим променем, а зображення отримують, рахуючи фотони на кожній позиції сканування.
Ідентифікація непружних розсіювачів і вимірювання відстані до них є важливими в багатьох областях, зокрема у флуоресцентній мікроскопії, яка є найпопулярнішим методом візуалізації в науках про життя. Флуоресцентні молекули (флуорофори) можна розглядати як непружні розсіювачі, оскільки вони втрачають частину енергії збуджуючого фотона перед тим, як випромінити фотон, а також гублять інформацію про фазу збуджуючого світла. Флуоресцентна мікроскопія «не бачить» цікаві молекули, наприклад, білки в клітині, як такі, а «бачить» лише флуоресцентні маркери, які зв’язані з цими молекулами як мітки. На перший погляд це невигідно, але насправді цей аспект є критичним для флуоресцентної мікроскопії високої роздільної здатності, оскільки там маніпулюють станами флуорофора для отримання роздільної здатності. Зокрема, флуорофори, які розташовані ближче за дифракційну межу розрізнення, розпізнаються шляхом тимчасового переведення їх у флуоресцентний стан (ON), тоді як решта зразка зберігається в темному стані (OFF). Переведення флуорофорів у різні стани на короткий проміжок часу забезпечує субдифракційну роздільну здатність. Цей перехід між станами ON/OFF є ключовим для всіх методів флуоресцентної наноскопії, відомих на сьогоднішній день: STED, PALM/STORM, MINFLUX і DNA-PAINT.
На жаль, розрізнення за станами ON/OFF має обмеження, які не дозволяють поширити такий спосіб отримання надвисокої роздільної здатності (superresolution) на інші типи розсіювання, наприклад, раманівське, не кажучи вже про неоптичні методи. Навіть у флуоресцентній мікроскопії принцип ON/OFF має серйозне обмеження: сусідні флуорофори реєструються послідовно. Це є недопустимим, якщо всі флуорофори необхідно спостерігати одночасно, як, наприклад, при молекулярному відстеженні (трекінгу).
У новій роботі [1] німецькі вчені показують, що сканування за допомогою сфокусованого світлового поля, яке має (центральний) дифракційний мінімум, а не максимум, дозволяє ідентифікувати та вимірювати відстані між відомою кількістю ідентичних флуорофорів аж до одиниць нанометрів. Шляхом спільної локалізації двох флуорофорів, розташованих на відстані лише 8 нм (для використаної довжини хвилі 640 нм це складає λ/80), показано, що критерій Релея сильно переоцінює мінімальну відстань, на якій можна розрізнити два розсіювачі. Також виміряно довжину сторони 22 нм для квадратного масиву з чотирьох молекул. Завдяки такому підходу безперервне відстеження двох або більше флуорофорів на нанометрових відстанях стає можливим. Також показано, що для заданого відношення сигнал/шум і фону, точність розрізнення зростає зі зменшенням відстані між розсіювачами. Цей несподіваний результат дозволяє поширити запропонований метод на більшу кількість розсіювачів, що має потенціал для спостереження нанометрових конформаційних змін окремих білків та інших (біо)молекул за допомогою світла.
1. Hensel, T.A., Wirth, J.O., Schwarz, O.L. et al. Diffraction minima resolve point scatterers at few hundredths of the wavelength. Nat. Phys. 21, 412–420 (2025). https://doi.org/10.1038/s41567-024-02760-1